神经干细胞移植在临床中面临的问题有哪些?

神经系统疾病是一种难治性疾病，可导致感觉丧失、运动功能丧失和记忆力减退，并直接威胁患者的生命。目前，这些疾病的致病因素及其发病机制尚不清楚。传统药物治疗用于延缓疾病进展，不能恢复功能或再生组织。最近的研究表明，神经干细胞（NSCs）的移植是治疗与神经系统相关的疾病、神经细胞再生和损伤部位微环境恢复的一种很有前景的治疗方式（图1）。

图1：用于治疗的NSC特性

NSC分泌可溶性因子，包括神经营养因子、生长因子和细胞因子，从而保护现有神经细胞免受原位损伤。此外，它们通过定向祖细胞分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，以替代丢失的神经细胞。神经保护或细胞替代均可通过神经再生帮助急性或慢性损伤后的神经功能恢复。

细胞来源是使NSC在临床治疗中应用必须解决的第一个问题，因为充分移植所需的细胞剂量非常高。利用最近的技术进步，可以从三种不同的来源获得NSC，包括从原代组织直接提取、从多能干细胞分化和从体细胞转分化（图2和表1）。

图2：NSC的来源

利用最近的技术进步，可以通过三种不同的方法获得NSC：从原发性CNS组织直接提取，包括胎儿脑、成人脑和脊髓组织；从多能干细胞分化，例如胚胎干细胞和诱导多能干细胞；以及从体细胞的转分化，如皮肤成纤维细胞、尿细胞和血细胞，这些细胞在临床上很容易获得。从上述来源产生的NSC可以通过基因改造进一步永生化

表1神经干细胞的来源

细胞分离和细胞培养技术的建立导致了有利的实验方法的发展，并为NSC研究确定了丰富的细胞来源。

1992年，Reynolds和Weiss从成年小鼠大脑的纹状体中分离出NSC，并报道了首次使用表皮生长因子（EGF）在体外诱导 NSC增殖。两年后，他们发现小鼠大脑的室管膜下区是体内NSCs的来源。

多能干细胞，包括胚胎干细胞 (ESC) 和诱导多能干细胞 (iPSC)，可以通过分化产生所需的细胞，这是原代细胞分离的有吸引力的替代方案。一般来说，多能干细胞的神经分化方案可分为两种主要途径：胚状体 (EB) 形成和单层培养。

转分化，也称为谱系重编程，最初是由Selman和Kafatos在1974年创造的。在此过程中，一种成熟的体细胞在不经历中间多能状态的情况下转化为另一种成熟的体细胞。该过程主要由谱系特异性转录因子 (TF) 的外源表达和化合物诱导。

神经退行性疾病是由大脑或脊髓中的神经或胶质细胞缺陷引起的，导致记忆力下降、认知障碍、痴呆或肢体运动障碍，主要包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（ AD) 和亨廷顿病 (HD)。

渐冻症（ALS）：ALS的特点是大脑皮层、脑干和脊髓中的运动神经元退化和丧失，从而导致肌肉萎缩、虚弱，并最终在5年内死亡。NSC分泌胶质细胞系衍生的神经营养因子和脑源性神经营养因子，在ALS转基因大鼠模型中诱导运动神经元的再生。此外，人iPSC衍生的NSC可有效改善神经肌肉和运动单位的功能，并在鞘内或静脉内注射后显着延长ALS小鼠的寿命。除了动物模型，NSC治疗ALS多年来一直处于临床试验阶段。临床结果表明这种脊髓注射治疗方法的安全性。

帕金森（PD）：PD是一种以黑质致密部和纹状体末端的多巴胺神经元丧失为特征的疾病。在毒素诱导的PD动物模型中，移植的人类 NSC 刺激大鼠星形胶质细胞去分化和外源性生长因子的分泌，从而通过调节病变微环境抑制小胶质细胞的活化并减缓 PD 进展。

尽管在PD动物模型中神经干细胞移植已显示出一定程度的益处，但仍需要进一步的研究来阐明其临床疗效和安全性。

迄今为止，一份报告证实人类孤雌生殖干细胞衍生的神经干细胞 (hpNSCs) 可以成功地移植、长期存活并增加啮齿动物和非人类灵长类PD模型大脑中的多巴胺水平。此外，hpNSCs的致瘤潜力可忽略不计，临床应用安全，因此支持批准基于hpNSC的I/IIa期研究用于治疗PD。

阿尔茨海默病（AD）：AD的特征是可溶性和不溶性淀粉样蛋白β肽水平升高。据报道，AD患者的海马神经元线粒体水平降低。将外源性神经干细胞移植到转基因AD小鼠中会导致线粒体数量和线粒体相关蛋白的表达显着增加，以及小鼠认知功能的改善。

亨廷顿病（HD）：HD是一种常染色体显性遗传病，可诱发尾状核萎缩，其特征是不自主的舞蹈动作、认知障碍和情绪障碍。临床发现NSC联合海藻糖的脑内移植不仅可以减轻多聚谷氨酰胺聚集形成并减少纹状体体积，而且还可以延长HD转基因小鼠模型的寿命。为了进一步促进神经干细胞移植在HD动物模型中的有益效果，移植和细胞制备的时机、神经干细胞的活性以及神经干细胞与辅助细胞（如分泌脑源性神经营养因子的间充质干细胞）的共移植需要充分考虑。根据病理情况考虑。

脊髓损伤（SCI）：脊髓损伤 (SCI) 是一种严重的身体损伤，通常会导致严重的运动功能丧失和继发性损伤。SCI尚无有效的常规治疗方法，但在SCI小鼠模型中移植NSC可显着改善运动功能恢复，从而表明NSC可以在体内存活、分化和改变早期慢性损伤部位的微环境。

中风（Stroke）：中风是一种急性脑血管疾病，包括缺血性和出血性中风。据报道，移植的小鼠iPSC衍生或人类胎儿衍生的 NSC 系可在缺血性和出血性中风动物模型中提供神经营养因子并增加血管生成和神经发生。此外，Li等人证明与单独移植NPC相比，与可能支持NPC存活的血管祖细胞共同移植可以更有效地改善神经血管恢复和减少梗塞体积。

创伤性脑损伤（TBI）：创伤性脑损伤的主要机制分为局灶性脑损伤和弥漫性脑损伤，分别对应接触损伤类型和加速/减速损伤类型。TBI极有可能导致认知和记忆缺陷以及运动障碍。

先前的研究得出结论，NSCs可以稳定TBI后的皮质微环境。将小鼠脑源性NSC移植到脑损伤小鼠体内可有效防止星形胶质细胞活化和小胶质细胞/巨噬细胞积聚，同时增加少突胶质细胞并修复和维持正常的神经元功能。载有bFGF的透明质酸钠胶原支架可促进移植的大鼠神经干细胞的存活和分化，并促进功能性突触形成以修复大鼠的创伤性脑损伤。

癫痫（Epilepsy）：癫痫是由于中枢神经系统兴奋和抑制失衡导致的脑神经元异常放电；这种不平衡导致短暂的脑功能障碍，主要与离子通道神经递质和神经胶质细胞的变化有关。近30%的颞叶癫痫 (TLE) 患者对抗癫痫药物耐药。

目前的报告表明，NSC移植可以抑制自发性癫痫发作。当移植到海马的癫痫部位时，外源性NSC会产生一种特定类型的神经元，该神经元合成抑制性神经递质γ-氨基丁酸和分泌抗惊厥因子的星形胶质细胞，从而减缓TLE引起的认知和情绪功能障碍。

脑瘫（CP）：脑性麻痹 (CP) 是一组出现在儿童早期的永久性运动障碍，这是由于发育中的中枢神经系统形成非进行性病变所致。目前，CP治疗包括许多措施，但这些治疗方法都不能治愈CP患者。

近年来，人们对NSC/NPC治疗CP的安全性和有效性进行了评估。基于目前的研究，移植血管内皮生长因子的NSCs可以部分减缓脑损伤，并对缺氧介导的CP新生大鼠具有神经保护作用，从而为CP治疗提供了一种新的潜在策略。

在临床上，已发现将流产的胎儿组织来源的NPC注射到患有CP的儿童的侧脑室后，运动发育和认知能力显着加快。此外，对接受骨髓间充质干细胞来源的神经干细胞样细胞移植的CP患者进行了长期随访。在此过程中观察到运动功能有所改善，但语言商数没有改善，这表明源自自体MSC的神经干细胞样细胞可能是CP治疗的更好细胞类型。

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）：缺氧缺血性脑病 (HIE) 是当整个大脑不完全缺乏足够的氧气供应时发生的一种疾病。最近的研究表明，通过NSC移植对新生儿脑病进行亚低温治疗可以减缓疾病进展并预防与HIE相关的长期损害。

其他疾病：年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的特征是光感受器的进行性丧失，它是视力丧失的主要原因。虽然AMD的治疗选择有限，但将人类NPC移植到视网膜变性啮齿动物模型中不仅可以阻止视力丧失的进展，而且可以长期保留感光器和视觉功能。一项I/II期临床研究正在调查人类NSC单侧视网膜下移植对继发于AMD的地理萎缩受试者的安全性和初步疗效。

表2通过神经干细胞移植治疗动物模型中的神经系统疾病

NSCs在治疗神经系统疾病方面表现出很大的可塑性，可被诱导分化为各种类型的成熟神经细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在特定条件下，NSCs具有广泛的分化库，甚至可以产生非外胚层细胞，包括造血细胞和骨骼肌原细胞。

此外，NSCs分泌神经营养因子，改善病变微环境，从而为病理修复创造适当条件。上述发现证实了NSC在基础研究和治疗应用中的重要价值。NSC移植的治疗效果可以通过辅助药剂、基因改造、三维移植或辅助细胞进一步提高，这可能会提高细胞的存活率和分化成特定类型的细胞。

最初，NSCs只能从胚胎大脑中获得，因此，来源有限、分离技术问题和低纯度阻碍了基于NSC的细胞疗法的进展。此外，还有伦理和道德问题。目前，新兴技术不断改进可用于获得NSCs的方法，特别是ESCs的鉴定和iPSCs的开发，从而能够获取大量NSCs，促进NSCs的基础研究。

首先，临床治疗必须遵守标准化方案。因此，必须为治疗程序建立详细而有效的标准，包括干细胞类型、移植时间和细胞剂量。NSC的纯度是重中之重，需要解决和批准，因为其他细胞的污染可能会导致意想不到的副作用。应针对每种类型的急性或慢性疾病评估NSC的最佳移植时间。与其他人一起，我们发现即使是原发性组织衍生的NSC或NPC也可以在体内形成凝块如果以高密度移植；因此，必须精确控制移植的神经干细胞的密度，以避免对注射组织造成二次损伤。NSC给药的治疗程序，包括通过颅内或脊柱内途径的局部注射以及通过静脉内或鞘内途径的全身注射，高度依赖于病变部位。

其次，用作种子的干细胞必须在体外和体内都经过验证是安全的。为此，我们建议对每批制造的NSC产品在小鼠体内进行深度测序和检查肿瘤形成效力。

第三，体内NSCs的低存活率和适度的治疗效果是仍有待解决的重大问题。此外，干细胞治疗的潜在机制仍不清楚，因此需要进一步的研究。相关领域的进一步基础研究可能有助于解决上述问题。最后，需要先进的成像技术来监测体内移植的神经干细胞的生理状态，以排除致瘤性和其他缺陷。

表3神经干细胞移植的临床试验